Заливка в парафин

После фиксации в формалине мозг промывают в проточной воде и обезвоживают в спиртах, причем концентрация спирта постепенно повышается. Срок пребывания мозга в спиртах, хлороформе и парафине указан в табл. 1.

Таблица 1

Сроки пребывания мозга в спиртах, хлороформе(ксилоле) и парафине (в днях)

Небольшие кусочки, вырезанные из мозга, в зависимости от их величины оставляют в каждом из реактивов на 1—1х/2 дня.

Препарат должен быть опущен в жидкость таким образом, чтобы она покрывала его поверхность полностью, чем больше жидкости, тем лучше фиксация. При смене спирта банки надо мыть или брать чистые. Употреблять 60°—70°—80° спирты 2 раза нельзя, тогда как спирт 96° II годен и для фиксации другого мозга, но как 96° I, а абсолютный спирт—как 96° II. Хлороформ можно использовать также 2 раза.

Если хлороформ не совсем чист, его необходимо профильтровать.

В хлороформе мозг всплывает, поэтому весь блок покрывают сверху тонким слоем ваты.

Парафином можно пользоваться несколько раз, но предварительно его необходимо профильтровать. Начиная с парафина I (42—44° плавкости), блоки находятся в термостате, температура которого должна быть выше плавкости парафина. Далее заливают блоки в парафин 52—54С плавкости. Для заливки приготовляют из плотной бумаги коробочку четырехугольной формы, размер ее несколько больше блока. В нее наливают немного парафина и кладут блок на ту поверхность, с которой надо начинать резать.

Блок 1—затылочный полюс, кладут на его переднюю поверхность; блоки 2—3—4—5—на их задние поверхности; нумерация препаратов; идет в каждом блоке отдельно.

На блок наливают расплавленный парафин плавкости 52—54° с таким расчетом, чтобы над блоком был довольно большой слой парафина, тол­щина всего блока не должна превышать 5—6 см.

Когда на поверхности жидкого парафина появится тонкая пленочка,, т. е. парафин начнет застывать, коробочку с блоком опускают в водком может долгое время оставаться в воде; чтобы она не перевернулась, ла ее (свободную, уже застывшую, поверхность кладут небольшой груз.

На другой день блок освобождают от коробочки, обрезают кругом лишний парафин, придают ему четыреугольную форму (обрезать очень близко к мозгу не надо, а также не следует придавать блоку круглую форму, так как в таком виде он хуже режется). На боковых поверхностях блока надписывают шифр мозга, порядковый номер блока и полушарие (правое или левое). Блок крепко прикрепляют к подставке микротома стороной, противоположной той, с какой предполагают резать. К подставке микротома сначала прикрепляют толстый слой чистого парафина, на который затем накладывают блок; предварительно нагревают обе поверхности раскаленным ножом, затем их соединяют, крепко прижимая одну к другой, щель между ними заделывают парафином и опускают в воду. Через 20—30 минут блок готов к резке.

Имеет значение ориентировка блока на подставке: если подставка имеет четырехугольную форму, необходимо, чтобы внутренняя поверхность полушария (которую хорошо видно на блоке) соответствовала длинной стороне подставки. Подставку с блоком вставляют в микротом следующим образом: внутренняя сторона полушария должна быть перпендикулярна к бритве, и повернута в сторону режущего так, чтобы при резке правого полушария ближайшей к бритве оказалась нижняя поверхность мозга, а при резке левого—верхняя.

Резать нужно при комнатной температуре (не ниже 18—19°). При более низкой температуре блок приходится согревать дыханием или время от времени класть на него тряпочку, смоченную горячей водой. Если же температура в комнате высока, на блок кладут тряпочку, смо­ченную холодной водой, или даже лед. Летом в жаркую погоду от резки лучше воздержаться, так как парафин пристает к ножу и препарат может разорваться. Режут срезы толщиной 20 мкм. Берут не все срезы, а каждый 20-й и 21-й] (20-й, 21-й, 40-й, 41-й, 60-й, 61-й и т. д.). Если предпола­гается несколько окрасок, то срезов берут больше.

После резки каждый срез переносят на заранее приготовленную бумагу с надписанными номерами и кладут под соответствующие номера в том положении, как их снимали с бритвы, не нарушая очередности. С бумаги срезы осторожно переносят в ванночку с водой (температура воды 34—35°), где они самостоятельно расправляются; из воды срезы вылавливают на заранее приготовленные стекла. Перед употреблением стекла моют в горячей воде, вытирают насухо и опускают на 24 часа в 96° спирт; перед резкой их вынимают риз спирта, вытирают насухо, на корот­кой стороне стекла у самого края алмазным карандашом надписы­вают шифр мозга, порядковый номер блока, полушарие (правое или левое), а в углу «на [прилегающей длинной стороне—порядковый номер, среза и его толщину (например:А 20 лев.4 1201.20мкм/ А20 пр. 2 860.20мкм) затем стекло сма­зывают специально приготовленным яичным белком (белок и глицерин в равных пропорциях сбивают и фильтруют в колбочку, куда кладут небольшой кусочек камфоры); срезы вылавливают на стекла с обратной стороны сделанной надписи.

При этом срез мозга помещают на стекле так, чтобы его верхняя поверхность соответствовала тому краю стекла, где имеется надпись, а внутренняя была обращена в правом полушарии влево, а в левом—вправо. Затем стекло со срезом и небольшим количеством воды переносят на сушильный столик при температуре 34—35°; срез слегка разглаживают и растягивают кисточкой, очень осторожно покрывают смоченной в воде пергаментной бумагой; слегка приглаживая тряпочкой по бумаге, из-под среза удаляют остальную воду. Готовые препараты кладут на сушиль­ную печь на 25—30 минут, а затем убирают в специальный шкаф для препаратов. В таком виде неокрашенные препараты могут сохраняться годами.

Заливка в желатин по Снесареву

Метод пригоден для эмбриологических исследований. Преимущество его заключается в том, что он не вызывает сморщивания материала. Рекомендуется для выявления тонкой межклеточной структуры соединительной ткани, а также для некоторых цитологических исследований.

Для заливки берут бесцветный прозрачный пищевой желатин и вначале из него готовят 25 % раствор. Для этого мелко нарезают нужное количество желатина, насыпают в широкогорлую банку и ставят в термостат при 37 °С до растворения. После этого часть приготовленного желатина разводят пополам теплым 1 % раствором фенола (карболовой кислоты) и таким образом получают 12,5 % раствор. Растворы желатина лучше готовить в небольших количествах по мере надобности.

После фиксации тщательно промытый материал переносят в 12,5 % раствор желатина, где держат в зависимости от величины кусочков от 1 — 2 ч до 1 — 2 сут, затем на такое же время переносят в 25 % раствор желатина при 37 °С. После заливки следуют быстрое охлаждение в холодильнике и уплотнение в 5— 10 % формалине. Блоки режут только на замораживающем микротоме.