КОМБИНИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ

Ускоренный метод окрашивания миелиновых волокон и нервных клеток по Викторову

Депарафинированные срезы окрашивают в течение 1 —2 ч в 0,01 % кислом спиртовом растворе люксолевого синего прочно­го, дифференцируют в 0,1 % растворе тетрабората натрия (буры) и докрашивают крезиловым фиолетовым прочным по Нисслю.

Растворы красителей и их изготовление. Раствор I: 1 г люк­солевого синего прочного, 5 мл ледяной уксусной кислоты, до 100 мл 96 % спирта. Для приготовления рабочего 0,01 % раствора

1 мл основного раствора красителя смешивают со 100 мл 96 % спи­рта. Рабочий раствор красителя можно использовать повторно.

Раствор II: 250 — 500 мг крезилового фиолетового прочного, 130 мг ацетата натрия, 1,2 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл дистиллированной воды. Забуференный раствор крези­лового фиолетового прочного для подкрашивания по Нисслю можно использовать неоднократно.

Методика окраски

1. Наклеенные на стекла парафиновые срезы толщиной 10 — 20 мкм депарафинируют в ксилоле и промывают в 100 % и 96 % спиртах.

2. Окрашивают в 0,01 % спиртовом растворе люксолевого си­него прочного 1 — 2 ч при 56 — 60 °С.

3. Промывают срезы последовательно в 96 % и 70 % спиртах и дистиллированной воде.

4. Дифференцируют в 0,1 % растворе тетрабората натрия, контролируя процесс под микроскопом (краситель постоянно удаляется из среза, а миелиновые волокна сохраняют яркую сине-зеленую окраску).

5. Ополаскивают в 5 % растворе уксусной кислоты.

6. Окрашивают крезиловым фиолетовым прочным в течение 2 — 5 мин.

7. Промывают в дистиллированной воде.

8. Обезвоживают в спиртах восходящей концентрации (70 %, 96 %, 100 %), просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Результат: миелин ярко-синего цвета; вещество Нисс ля, ядра нейронов, глиоцитов, клеток сосудов и оболочек мозга фиолетовые.

Метод избирательной импрегнации дегенерированных нервных волокон и окончаний

Фиксацию мозга лабораторных животных проводят методом прижизненной перфузии 10 % раствором нейтрального формалина на изотоническом растворе хлорида натрия через левый желудочек сердца. После перфузии мозг дополнительно фиксируют в тече­ние 10—14 дней в 10 % растворе нейтрального формалина, а за 1 — 2 дня перед резкой помещают в 30 % раствор сахарозы, что предупреждает повреждение ткани при замораживании. В раство­ре формалин-сахарозы мозг может храниться долго.

Срезы толщиной 25 — 40 мкм, полученные на замораживаю­щем микротоме, собирают в 10 % раствор формалина, в котором и хранят до последующей обработки.

Растворы и их приготовление. А. Кислый раствор соли пяти­валентного ванадия: навеску в 1,2 г метаванадата аммония (аммо­ний ванадиевокислый) растворяют в 150 — 200 мл горячей дис­тиллированной воды, после охлаждения раствора к нему добав­ляют 5 мл концентрированной серной кислоты и доводят его объем до 1000 мл. Удобно готовить также концентрированный раствор: 12 г метаванадата аммония растворяют в 500 мл горячей дистиллированной воды. К полученному раствору после охлаж­дения небольшими порциями добавляют 50 мл концентрирован­ной серной кислоты и доводят его объем до 1000 мл. Если при до­бавлении серной кислоты выпадает бурый осадок пятиокиси ва­надия, то его растворяют при нагревании. Перед применением к 1 части концентрированного раствора добавляют 9 частей дистил­лированной воды. Кислый раствор метаванадата аммония может храниться в течение длительного времени. Б. Раствор нитрата серебра 3 %.

В. Аммиачно-натриевый раствор: в 100 мл 25 % водного рас­твора аммиака растворяют 1,25—1,5т гидроксида натрия. Рас­твор хранят в плотно закрытой склянке с полиэтиленовой проб­кой.

Г. Раствор аммиачного серебра (готовят перед использовани­ем): к 50 мл 3 % аммиачного серебра добавляют б мл аммиачно-натриевого раствора.

Д. Редуцирующий раствор: 27 мл 10 % формалина, 87 мл 1 % лимонной кислоты, 90 мл 96 % спирта, до 1000 мл дистиллирован­ной воды.

Е. Смесь равных объемов 1 % раствора тиосульфата натрия и 1 % раствора сульфита натрия.

Импрегнация срезов

1. Срезы промывают в течение 5 мин в 2 сменах дистиллиро­ванной воды.

2. Помещают в кислый раствор метаванадата аммония на 10— 15 мин.

3. Промывают в 2 сменах дистиллированной воды 5 мин.

4. Переносят на 25 — 30 мин в 3 % раствор нитрата серебра (срезы приобретают светло-коричневый цвет). Далее каждый срез обрабатывают отдельно.

5. Ополаскивают в дистиллированной воде (5— 10 смен).

6. Помещают на 1 — 2 мин в раствор аммиачного серебра.

7. Без предварительного промывания проводят через 2 смены редуцирующего раствора (1-я смена — 1 мин, 2-я смена — 2 — 3 мин).

8. Промывают 1 — 2 мин в дистиллированной воде.

9. Помещают на 1 — 2 мин в смесь равных объемов 1 % рас­творов тиосульфата натрия и сульфита натрия.

10. Тщательно промывают в 2 сменах дистиллированной воды в течение 10—15 мин.

11. Промытые срезы наклеивают на предметные стекла спир­товым раствором желатина и хромовых квасцов (в 200 мл 0,5 % раствора желатина растворяют 100 мг хромовых квасцов; чис­тые предметные стекла погружают в этот раствор, вынимают и сушат в вертикальном положении). Наклеенные и хорошо про­сушенные срезы обезвоживают спиртом, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Примечания. 1. Продолжительность обработки срезов, описанной в пунктах 2, 4, 6, определяют опытным путем для каждой серии срезов.

2. Качество препаратов значительно улучшается, если срезы, наклеенные на предметные стекла, докрасить растворами крези-лового фиолетового прочного или толуидинового синего.

Результат: фон препаратов светло-желтый, реже коричне­вый; дегенерированные волокна — черные; в местах окончания дегенерированных волокон выявляют тела нервных клеток и ядра нейроглии, имеющие различные оттенки фиолетового цвета.

Методика дифференцированного выявления нейронов и глии на парафиновых срезах

Гистохимические методы, в частности методы определения бел­ковых веществ, не позволяют дифференцировать типы глии, поскольку обычно у глиальных клеток различимы только структу­ры ядра. Ставя задачу разработать метод дифференцированно­го определения нейронов и глиальных элементов на гистохими­ческих препаратах, авторы попытались объединить метод Альцгеймера, предназначенный для выявления митохондрий, нейро-сом, телец Ниссля и астроцитарной глии, и гистохимический ] метод определения общего белка с применением амидо черного 10Б. Метод Альцгеймера основан на различном сродстве органоидов клетки к красителям: в нейронах митохондрии и нейро-сомы окрашиваются в ярко-красный цвет, вещество Ниссля — в зеленый, а тела амебовидных клеток — в зеленоватый, глиаль-ные и соединительнотканные волокна — в красный. Метод с применением амидо черного 10Б позволяет обнаружить общий и суммарный белок в ткани мозга по окрашиванию его скоплений в зеленый цвет. В результате исследования разработана следую­щая схема.

Кусочки ткани мозга после фиксации в жидкости Карнуа проводят по обезвоживающим средам и заключают в парафин. Срезы толщиной 5—10 мкм приклеивают белком на предметные стекла.

1. Срезы депарафинируют и через спирты нисходящей кон­центрации доводят до воды.

2. Переносят в 0,03 % раствор амидо черного 10Б на ацетат­ном буфере (рН 5,32) при комнатной температуре на 20 мин.

3. Промывают в дистиллированной воде.

4. Инкубируют в насыщенном водном растворе кислого фук­сина при 56 °С 30 мин.

5. После охлаждения до комнатной температуры ополаскива­ют в дистиллированной воде.

6. Дифференцируют в пикриновой кислоте (15 мл насыщен­ного спиртового раствора пикриновой кислоты и 30 мл дистил­лированной воды) 15 с.

7. Ополаскивают в дистиллированной воде и обсушивают фильтровальной бумагой.

8. Дифференцируют в 100 % спирте около 2,5 с.

9. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Результат: отчетливо выявляются белки в телах и митохонд­риях нейронов, а также в ядрах глиальных клеток. Последние значительно различаются по интенсивности окраски в зависи­мости от принадлежности к тому или иному типу глии: карио­плазма и хроматиновые структуры ядер олигодендроглиоцитов интенсивно-красного цвета, а у астроцитов в красный цвет окра­шены ядрышко и небольшое количество зерен хроматина.

Метод Герлаха

Для выявления грубых отростков ганглиозных клеток и более крупных тяжей волокон рекомендуется метод Герлаха. При этом важно, чтобы препараты до окрашивания кармином не со­прикасались со спиртом.

Материал фиксируют в жидкости Мюллера или 3 — 5 % растворе бихромата калия. Продолжительность фиксации мозга птиц и лягушек составляет несколько недель, головного и спин­ного мозга человека — несколько месяцев и даже лет. Срезы получают на замораживающем микротоме и в течение несколь­ких часов промывают в воде. Окрашивают в разбавленном рас­творе аммиачного кармина 24 — 48 ч. Очень важно правильно приготовить раствор: растирают 1 г кармина, приливают 100 мл дистиллированной воды и добавляют по каплям 26 % раствор аммиака (нашатырный спирт) в таком количестве, чтобы краси­тель полностью растворился. После этого раствор должен со­зреть в открытом сосуде до полного исчезновения запаха аммиа­ка. К употреблению годны лишь растворы, стоявшие в течение длительного времени. Перед использованием основной раствор разбавляют дистиллированной водой настолько, чтобы для ок­рашивания срезов потребовалось 24 — 48 ч. Раствор кармина можно использовать повторно (со временем он даже становится лучше). Срезы дифференцируют в слабо подкисленной уксус­ной кислотой воде 1 — 2 ч; промывают, проводят через спирты возрастающей концентрации, ксилол и заключают в бальзам.

Результат: ганглиозные клетки с отростками интенсивно-красные; осевые цилиндры нервных волокон и ядра клеток красные; волокна глии розовые; мякотные оболочки остаются неокрашенными. Если срез предварительно окрасить гематокси­лином, то ядра окрашиваются контрастно в синий цвет.

Метод аксонального электрофореза солей кобальта для исследования мозга млекопитающих

Создание метода заполнения нервных структур солями кобаль­та (Со-метод) у позвоночных животных [Ри11ег Р.М., Рпог 1975] открыло широкие возможности для избирательного окрашивания определенных систем нервных клеток и волокон, напоминающего импрегнацию по методу Гольджи.

Метод отрабатывали на корешках тройничного, языкогло-точного и блуждающего нервов взрослых крыс и латеральном обонятельном тракте котов при пропускании тока 5 — 50 мкА и длительности электрофореза 2 —24 ч.

1. Животное умерщвляют внутрибрюшинным введением наркотических веществ. Все дальнейшие процедуры до окончания эксперимента обязательно проводят на холоде и используют хо­лодные растворы (4 °С). Мозг перфузируют через сердце 200 мл трис-НС1-буфера (рН 7,4), содержащего 154 мМ хлорида натрия, 5,6 мМ хлорида калия, 2,3 мМ хлорида кальция и 0,25 М сахаро­зы, быстро и осторожно достают из черепной коробки и помещают в фарфоровую чашку с таким же раствором.

2. Аксональный электрофорез солей кобальта: корешок че­репного нерва перерезают острым скальпелем, центральный конец корешка или тракта помещают в полиэтиленовую трубку, диаметр которой немного больше диаметра корешка или тракта.

Этот конец фиксируют к стенке клеем МК-6 или вазелином, ко­торый одновременно герметически закупоривает трубку с этого конца. С противоположной стороны трубки наливают 130 мМ раствор дихлорида кобальта. Составляют электрическую цепь, в которую последовательно включают батарею постоянного тока (100-АМЦГ-У-190), микроамперметр, реостат и электроды. Один платиновый электрод (плюс) помещают в раствор дихло­рида кобальта, другой (минус) — в раствор, омывающий мозг. Пропускают постоянный электрический ток силой 40 мкА в те­чение 6 ч. В процессе эксперимента через каждый час полнос­тью меняют раствор, омывающий мозг.

3. Осаждение солей кобальта: по окончании эксперимента вырезают подлежащий изучению участок мозга (размером 20х10х5 мм), который для одновременного осаждения Со2+ и фиксирования нервной ткани помещают на 10 ч в смесь, состоя­щую из 2 мл 10 % сульфида натрия и 100 мл 70 % спирта. При удачном заполнении корешка нерва или тракта почернение его наступает уже через 10 с.

4. Получение гистологических препаратов: после кратковре­менного промывания в 70 % спирте (10 мин) кусочек мозга обезвоживают в спиртах: 96 % — 1 ч, в 100 % — 1 ч, в 100 % — 2 ч; помещают последовательно в смесь 100 % спирта и хлоро­форма (1:1) и хлороформ до тех пор, пока он не опустится в каждом из этих растворов на дно сосуда, затем обычным спосо­бом заливают в парафин. Мозг режут на непрерывные серийные срезы толщиной 20 — 25 мкм, наклеиваемые белком на стекла. Срезы на стеклах депарафинируют в ксилоле и проводят по спиртам нисходящей концентрации до воды.

5. Усиление осадка сульфида кобальта: для выявления малых количеств кобальта в нервной ткани используют физи­ческий проявитель. Срезы на стеклах помещают в чашку Петри, заливают проявителем и ставят в термостат при 37 °С на 20 — 30 мин. Необходимо избегать попадания прямого солнечного света. Окрашивание доожно контролировать визуально и пре­кращать при появлении слабо-желтого или коричневого фона на стороне введения кобальта путем промывания срезов водой (не­сколько смен по 5 мин). Затем срезы обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, просветляют в ксилоле и заключа­ют в бальзам.

6. С целью выявления не содержащих кобальт и поэтому не окрашенных нервных элементов срезы можно докрашивать 0,15 % галлоцианином по Ромейсу или 0,2 % крезиловым фио­летовым по Викторову.

7. Все растворы готовят на дистиллированной воде, реакти­вы должны быть химически чистыми.

Физический проявитель состоит из раствора А — 25 % гум­миарабик, раствора В — 2 % гидрохинон в 5 % растворе лимон­ной кислоты, раствора С — 10 % раствор нитрата серебра. Растворы А, В и С можно хранить в темном прохладном месте в те­чение 2 нед. Рабочий раствор готовят непосредственно при про­явлении срезов, последовательно смешивая 10 частей А, 10 час­тей В и 0,2 части С. Гуммиарабик в растворе А можно заменить 4 % раствором желатина и рабочий раствор тогда составляют из 8 частей А, 3 частей В и 0,1 части С.

Результат: сенсорные волокна и их терминальные ветвления заполнены кобальтом и имеют четкие контуры; окрашенные нервные клетки и их аксоны легко отличимы от заметных иног­да на препарате в виде теней не заполненных кобальтом нерв­ных элементов, дендриты можно проследить на расстоянии 100— 150 мкм от тела клетки; набухания и фрагментации воло­кон, изменения формы и объема нейронов не наблюдается. Весь препарат имеет слабо-желтый фон, окрашенные волокна и клет­ки черного цвета.

Методика фотооксидации флюоресцентных препаратов секционного материала мозга человека для световой и электронной микроскопии

Для системного выявления нейронов и проводящих путей мозга человека применяют внутриклеточное введение люциферового желтого (ЛЖ) и мембранный транспорт карбоцианиновых кра­сителей, в основном 1,1-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндо-карбоцианин перхлорит (ДИЛ).

1. В секционном материале мозга человека, взятом спустя 7 — 16 ч после смерти, через микроэлектрод вводят Л Ж в пирамидные нейроны зрительной, фронтальной коры и непирамид­ные нейроны гиппокампа, а карбоцианиновые красители (в ос­новном ДИЛ) — в белое вещество или различные слои зритель­ной коры.

2. Вибратомные срезы (толщиной 75—150 мкм), окрашен­ные ЛЖ или ДИЛ, помещают в чашку Петри и прижимают к ее дну металлическим грузом; наливают раствор, состоящий из 1 мг/мл 3,3'-диаминобензидина-4 (ДАБ) и 1 мг/мл цианида калия на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4).

3. Для фотооксидации чашку Петри со срезами помещают под флюоресцентный микроскоп. Используют эпифлюоресцен-цию через объективы с увеличением в 6,3 или 10 раз и соответ­ствующие светофильтры: для Л Ж — максимум возбуждения 470 нм, для ДИЛ — 546 нм.

4. Через 1 — 2 ч (время колеблется в зависимости от плотнос­ти освещения, толщины препаратов и флюоресцентного вещества) срезы мозга промывают 3 раза фосфатным буфером. Можно проводить несколько процедур фотооксидации на одном и том же срезе, каждый раз меняя раствор.

5. Для проведения световой микроскопии срезы помещают на предметные стекла, смазанные белком, высушивают, обезвоживают в спиртах восходящей концентрации, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

6. Для осуществления электронной микроскопии срезы поме­щают на 7 — 10 мин в 0,5 % раствор тетраоксида осмия на фос­фатном буфере, промывают 3 раза тем же буфером, обезвожи­вают в спиртах восходящей концентрации и заключают между двумя целлофановыми листочками.

7. Срезы, окрашенные ЛЖ, дополнительно контрастируют в урани л ацетате. Срезы, окрашенные ДИЛ, этой процедуре не подвергают, так как в этом случае на электронно-микроскопи­ческом уровне невозможно отличить мембраны, окрашенные ДИЛ, от мембран, контрастированных уранилацетатом.

Результат: выявляются пучки аксонов с коллатералями и бусинками по ходу, очень четко окрашиваются также отдельные терминальные волокна с бусинками по ходу или шипикоподоб-ными образованиями; нейроны выявляются со всеми деталями. На электронограммах нейроны и дендриты, окрашенные ЛЖ, имеют более темный профиль.

Использование метода фотооксидации позволяет преобразовать флюоресцентные препараты в световые, которые также годны для электронной микроскопии.